Deux ans après les événements cataclysmiques qui ont ravagé New York[5], Steve Rogers vit désormais à Washington DC, où il s’efforce de s'adapter au monde moderne.

Pendant son jogging, Steve rencontre Sam Wilson, un ancien militaire qui occupe un poste administratif et aide les vétérans à se réintégrer. Alors qu'ils sympathisent, Natasha Romanoff arrive et emmène Steve en mission : ils doivent sauver les otages d'un navire du SHIELD, le Lemurian Star, dans l'océan Indien, qui a été détourné par George Batroc, un criminel français. Captain America, l'agent Rumlow, Romanoff et leurs hommes se battent contre le groupe de pirates de Batroc et sauvent les otages. Mais il s'avère que Natasha doit également accomplir une autre mission : récupérer des données secrètes du SHIELD dans un ordinateur du Lemurian Star.

Plus tard, au Triskell (le quartier général du SHIELD), qui se trouve à Washington DC, Nick Fury découvre que les données récupérées sur la clé USB lui sont inaccessibles. Après avoir été attaqué sur la route et sévèrement blessé par de faux policiers et par un homme masqué muni d'un bras métallique, il se rend chez Steve, lui donne la clé USB et lui dit de ne faire confiance à personne. Il prend alors une balle tirée par l'homme masqué, que Steve poursuit brièvement avant qu'il ne lui échappe.

Nick est opéré, mais il décède un moment plus tard, les chirurgiens n'ayant pas réussi à le sauver, et son corps est emmené par Maria Hill. Au Triskell, le secrétaire Alexander Pierce, un haut gradé du SHIELD, demande à Steve pour quelle raison Fury se trouvait chez lui. Comme Steve refuse de lui répondre, Pierce le considère comme un traître, et de nombreux agents du SHIELD se lancent à sa poursuite.

Il réussit à s'échapper et Natasha se joint à lui. Elle révèle à Steve que la plupart des services de renseignement ne croient pas à l'existence de l'homme qui a tiré sur Nick, et que ceux qui y croient l'appellent le Soldat de l'Hiver. On lui a attribué plusieurs dizaines d'assassinats au cours de ces cinquante dernières années. En analysant les données de la clé USB, Steve et Natasha trouvent un bunker dans le New Jersey, dans lequel se trouve un ordinateur qui a conservé la conscience d'Arnim Zola, le scientifique qui travaillait pour Crâne rouge pendant la Seconde Guerre mondiale. Capturé par la SSR (Section Scientifique de Réserve) avant la fin de Crâne rouge et d'HYDRA, il a été recruté par le SHIELD et la nouvelle HYDRA a grandi à l'intérieur de l'organisation depuis sa création après la guerre. Zola révèle à Steve et Natasha que lorsque le processus d'un algorithme qu'il a créé sera terminé, le nouvel ordre mondial d'HYDRA verra le jour. Alors que le bunker est détruit par un missile, Steve et Natasha réussissent à s'échapper.

Rejoints par Wilson qui a récupéré un exosquelette lui permettant de voler, le groupe comprend que l'agent Jasper Sitwell est une des taupes d'HYDRA et l'interrogent. Il leur révèle que grâce à l'algorithme de Zola, HYDRA pourra sélectionner comme cible les personnes qui constituent une menace présente ou future pour elle, et qu'elle compte les rayer de la liste avec les trois nouveaux héliporteurs du projet Insight. Ces héliporteurs sont équipés de nouvelles mitrailleuses de précision à très longue portée pouvant éliminer mille ennemis à la minute. Ils sont ensuite attaqués par le Soldat de l'Hiver et ses hommes ; au cours du combat, Steve parvient à lui retirer son masque et reconnaît Bucky, son ami d'enfance, laissé pour mort lors de la Seconde Guerre mondiale. Bucky ne reconnaît cependant pas Steve, et s'apprête à le tuer, mais il est neutralisé par Natasha et Sam, avant que le SHIELD n'arrive sur les lieux et ne les arrête tous les trois.

Ils sont cependant exfiltrés par l'agent Maria Hill, qui les mène à Fury : ce dernier avait simulé sa mort. Il s'avère qu'après sa chute dans les montagnes suisses, Bucky avait été récupéré par Zola, qui lui a lavé le cerveau et l'a muni d'un bras cybernétique. Depuis ce jour, Bucky est devenu un assassin redoutable au service d'HYDRA. Quant à Pierce, il est en réalité à la tête d'HYDRA. Hill fournit des clés numériques pour désactiver les trois héliporteurs.

Alors que les quatre membres du Conseil de Sécurité mondiale (le Conseil chargé de superviser les activités du SHIELD) se rendent au Triskell, Steve diffuse un message pour dévoiler l'infiltration d'HYDRA dans le SHIELD. Le chaos se déclenche alors, et les agents d'HYDRA combattent alors ceux du SHIELD, dans la confusion la plus complète. Captain America et le Faucon réussissent à désactiver deux héliporteurs, mais le Soldat de l'Hiver détruit l'exosquelette du Faucon et combat Steve sur le troisième. Pendant ce temps, Natasha divulgue tous les secrets du SHIELD et d'HYDRA sur internet afin de démanteler les deux organisations. Steve réussit à désactiver le dernier héliporteur, et l'agent Hill les réoriente les uns sur les autres.

Steve finit par raisonner Bucky et ce dernier le sauve alors que l'héliporteur sombre dans l'océan. Pierce est abattu par Fury. Toujours officiellement mort, Fury révèle à Steve et Sam qu'il reste encore de nombreux agents d'HYDRA en liberté, et il décide ensuite de se rendre en Europe, tandis que Steve et Sam décident de partir à la recherche de Bucky.

Après le générique, on voit le Baron von Strucker, désormais aux commandes d'HYDRA, qui a récupéré le sceptre de Loki et retient prisonniers Pietro Maximoff et Wanda Maximoff… À la toute fin, on voit Bucky visiter l'exposition sur Captain America et enfin comprendre le lien qui les unit.